發(fā)生污染，既耽誤時(shí)間又是一個(gè)災(zāi)難，熟練的無(wú)菌操作能避免許多問題，但早期檢測(cè)污染是一種可以預(yù)警的方法。對(duì)于培養(yǎng)箱中的每瓶細(xì)胞都要注意觀察，要養(yǎng)成習(xí)慣，每次打開培養(yǎng)箱時(shí)，迅速看看有沒有發(fā)生污染。

細(xì)菌、酵母、真菌、霉菌、支原體以及其他的培養(yǎng)細(xì)胞都可能引起污染。

怎樣識(shí)別污染

一、肉眼觀察，把培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿拿起來(lái)，對(duì)著光線檢查。

• 渾濁情況。即使細(xì)胞密度很高，培養(yǎng)基也應(yīng)該是透明的。輕輕移動(dòng)或晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，觀察培養(yǎng)基的渾濁或懸浮情況，一些霉菌可能會(huì)在培養(yǎng)基的表面形成菌落。

• 培養(yǎng)基顏色的變化。酸性條件下，加了酚紅的培養(yǎng)基會(huì)由紅變黃，而堿性條件下會(huì)變成紅紫色。細(xì)菌污染常常會(huì)使培養(yǎng)基變成黃色，真菌污染會(huì)使培養(yǎng)基變成深紫紅色。

• 聞！當(dāng)然不能打開瓶子去聞，把鼻子貼在瓶口聞，許多污染發(fā)生以后都會(huì)散發(fā)出易察覺的、特殊的氣味，甚至一打開培養(yǎng)箱門就聞到了。

二、顯微觀察。在倒置顯微鏡下，先用低倍(10 X) 再用高倍(40 X) 物鏡（總放大倍數(shù)為400) 觀察細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞：

• 其他有機(jī)體。在低倍鏡下，真菌的菌絲體成長(zhǎng)棒狀，并橫穿整個(gè)視野，還可以觀察到酵母，有時(shí)呈小圓球形，有時(shí)還有芽。

在高倍鏡下可以觀察到細(xì)菌，它們可能是棒狀或球狀，單獨(dú)成鏈或成團(tuán)存在，它們也可能和細(xì)胞混在一起，并且明顯處于細(xì)胞內(nèi)部，有些細(xì)胞可能已經(jīng)裂解變得模糊。觀察時(shí)可能每?jī)蓚€(gè)視野才出現(xiàn)一個(gè)污染（當(dāng)然也算被污染了！），而且可能污染物是可以運(yùn)動(dòng)的。

• 損傷細(xì)胞。感染會(huì)殺死細(xì)胞，可能導(dǎo)致每個(gè)細(xì)胞都裂解和／或細(xì)胞層從附著物上*剝離，更可能的是細(xì)胞變得不規(guī)則（或大或?。?，在低倍鏡下是黑色的粒狀

懸浮培養(yǎng)細(xì)胞比貼壁培養(yǎng)細(xì)胞更加難以顯微觀察，尤其是高倍顯微鏡下。

• 將培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿放在顯微鏡的載物臺(tái)上，靜置一會(huì)。

• 將焦距對(duì)準(zhǔn)器皿的底部，觀察那些輕微附著的細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兛赡芤呀?jīng)接觸到了微生物。

• 對(duì)準(zhǔn)整個(gè)培養(yǎng)瓶焦距，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的時(shí)候，用細(xì)聚焦調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)節(jié)，仔細(xì)檢查周圍的培養(yǎng)基有沒有污染發(fā)生。

如果你不能確定是否發(fā)生了污染

• 制作濕涂片或染色片。取1 ml 培養(yǎng)基離心，用50 μl 培養(yǎng)基或緩沖液重新懸浮細(xì)胞，滴一滴到載玻片，蓋上蓋玻片制成濕涂片；或涂片、固定并染色（甲基蘭或革蘭氏染液），在高倍鏡下觀察。

• 將細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基或瓊脂培養(yǎng)基上劃線， 37℃培養(yǎng)3 天。如果有菌落，那么細(xì)胞被污染了。

• 取1 ml 的細(xì)胞培養(yǎng)液至無(wú)菌的微量離心管中， 37℃培養(yǎng)3 天。觀察到渾濁物，做濕涂片顯微鏡觀察。

Mynox®殺除支原體功能強(qiáng)大有效，但價(jià)格較貴。

方法三：對(duì)于已耗費(fèi)很多時(shí)間，大量擴(kuò)增起來(lái)的細(xì)胞，或經(jīng)過基因轉(zhuǎn)染、體外刺激等大量工作處理過的細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞被支原體污染了，怎么辦？此時(shí)由于前期工作量巨大，使操作人員無(wú)法丟棄已有細(xì)胞。

但由于價(jià)格原因，又無(wú)法使用方法二提到的昂貴試劑殺除細(xì)胞上的支原體，

同時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員還需要清除細(xì)胞上的支原體污染，讓實(shí)驗(yàn)得以往下推進(jìn)，以最終獲得準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

此時(shí)，實(shí)驗(yàn)者可選用對(duì)支原體有效的抑制劑，通過對(duì)細(xì)胞的前期處理，中期加藥，逐步通過4代左右的培養(yǎng)，得以將支原體污染*清除，確保試驗(yàn)順利推進(jìn)，結(jié)果準(zhǔn)確。

此類試劑眾多，筆者周圍的實(shí)驗(yàn)人做過很多嘗試，其中效果最確切且性價(jià)比較高的當(dāng)屬德國(guó)Minerva公司的ZellShield®祛除劑。

它的原理是：通過抑制支原體增殖中DNA和蛋白的合成，達(dá)到抑制新的支原體增殖的目的。屬?gòu)?fù)合型的新型抗生素。

注：使用ZellShield®時(shí)，不需使用鏈青霉素。

 

操作步驟：

第一步：研究發(fā)現(xiàn)，98%的支原體污染發(fā)生在細(xì)胞間隙。因此，首先要把細(xì)胞消化下來(lái)，放入離心管，懸浮沖洗，離心，棄上清，反復(fù)三次。此時(shí)可將細(xì)胞上大部分的支原體去除，為進(jìn)一步加藥抑制做好準(zhǔn)備。

第二步：培養(yǎng)液中加入1%的ZellShield®，細(xì)胞進(jìn)行正常培養(yǎng)。新的支原體增殖受到抑制，舊的支原體隨著細(xì)胞的換液逐步減少，通過4代左右的培養(yǎng)，細(xì)胞中的支原體基本可被*清除。